宜宾多粮型白酒窖房空气中产糖化酶的霉菌 蒲岚 2，王涛 1，2，周宇科 2，姚韬 1，游玲 2，王松 1，2，冯瑞章 1，2 【摘 要】摘要：对分离自窖房空气中的 104 株霉菌产糖化酶能力进行检测，发 现其中有 14 株具备产糖化酶能力。结合形态、特征和基于 ITS nu-rDNA 的系 统 发 育 分 析 ， 此 14 株 菌 分 属 于 Aspergillus(6 株 ) 、 Mucor(3 株 ) 、 Penicillium(2 株 ) 、 Rhizopus(1 株 ) 、 Gibberella(1 株 ) 、 Cladosporium(1 株)6 个属，Aspergillus 为优势属，显示浓香型白酒窖房中空气存在多样性较 为明显的产糖化酶霉菌。 【期刊名称】酿酒科技 【年(卷),期】2012(000)009 【总页数】4 【关键词】窖房；霉菌；糖化酶；ITS nu-rDNA 浓香型白酒的酿造是一种固态、厌氧的半自然发酵过程，依赖于生产环境内众 多微生物的协同参与，其代谢机理复杂[1]。在浓香型白酒酿造工艺中，发酵原 料在窖房中混入曲粉后再入窖发酵，此过程中窖房空气里的部分微生物会接种 至发酵原料并参与白酒酿造。
在窖内发酵过程中，酿酒原料所含淀粉在糖化酶 的催化下水解生成葡萄糖后糖化酶白酒生产，才能被用于微生物增殖及各种代谢产物的合成[2]。 因此糖化酶白酒生产，糖化酶在浓香型白酒酿造过程中扮演着重要的角色，而且目前行业内普 遍认为，淀粉质原料糖化发酵的不完全是浓香型白酒产酒率偏低的主要原因[3]。 对浓香型白酒窖房空气中具有产糖化酶能力的霉菌开展研究，有利于认识浓香 型白酒不同酿造环节的微生物在酿造过程中所起的作用，进而为生产环境中微 生物区系的调控及改进生产提供基础数据。同时，这些霉菌也是一类重要的生 物资源，具有潜在应用前景。 1 材料与方法 1.1 材料、仪器 供试菌株：分离自川南多家规模以上多粮浓香型白酒企业窖房空气，经过菌落 和孢子（菌丝）特征去除冗余的 104 株霉菌。 仪器试剂：PCR 仪为 Bio-Rad 公司产品；菌株 DNA 提取、ITS 片段扩增所用 的各种酶、Marker、dNTPs、Buffer 等试剂为上海生物工程技术服务有限公 司产品（San-gon）；其余试剂均为国产分析纯。 1.2 实验方法 1.2.1 产糖化酶能力检测 参照文献[4]配制产糖化酶检测平板。保存菌株活化后，制备孢子悬液，调整浓 度至 107/mL，点接 10 μL 于检测平板，36℃培养 4～6 d，检测菌落（d）及 其周围透明圈（D）的直径，计算 D/d 值。
1.2.2 产糖化酶霉菌的形态特征和 pH 值耐受检测 纯化培养 7～10 d 后，制片观察菌丝形态、孢子梗形态、孢子形态以及孢子与 营养菌丝之间的着生关系，同时结合菌落特征，对照有关资料初步确定其真菌 分类学地位[5]。采用混合有机酸（等体积比的乙酸、乳酸、己酸）调节液体 PDA 培养基 pH 值（5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.5），装液量（200 mL/500 mL）,10%接种量（孢子悬液），28℃下以 120 r/min 培养 3 d，过滤，烘干， 称重。 1.2.3 产糖化酶霉菌的系统发育分析 根据文献[6]提供的方法适当修改。提取霉菌基因组 DNA 后，使用引物 ITS 1： 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和 ITS 4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′ 扩增出 ITS 片段。PCR 反应体系和反应条件参照 White 等的方法进行[6]。扩 增的 PCR 产物送上海生物工程技术服务有限公司（Sangon）纯化并测序，测 序长度 500～700 bp，所得序列上传至 GenBank，序列号在 JN226906～ JN226988 之间。
所得序列用 Blast 在线进行相似性分析，用 ClustalX 按照最大同源性的原则进 行比对，采用 Kimura-2[7]计算序列相似值；采用 ClustalX 进行系统进化树的 构建并用 Mega 4.0 进行系统进化树的构建、编辑与保存。 2 结果与分析 2.1 产糖化酶霉菌及其 pH 值耐受 104 株供试霉菌中，14 株具备产生糖化酶的能力(占供试菌株总数的 13.79%)， 其水解圈直径与菌落直径之比(D/d)在 1.01～1.74 之间（见表 1）。其中，产酶 强度最高的 J8M-53 的 D/d 值达到了 1.74，远高于其他菌株。其他 13 株菌 D/d 值均在 1.10 以下，其中仅 4 株（Z8M-58、W8M-30、W8M-33 和 J8M-57）的 D/d 值超过了 1.05。从这些霉菌的 pH 值耐受情况来看，耐 pH4.0 和 pH5.0 的各有 7 株。耐 pH4.0 的 7 株菌中，产酶强度较高的只有 Z8M-58(D/d＝1.09)，而其余产酶能力较强的 4 株菌（D/d＞1.05）均只能耐 受 pH 5.0 的酸性环境。 2.2 产糖化酶霉菌的系统发育分析 14 株产糖化酶霉菌的 ITS nu-rDNA 序列与 Gen-Bank 中对应菌株的相似度在 99%～100%之间，其中有 5 株的 Max ident 达到 100%（表 2）。
结合序列比 对和系统发育分析结果（图 1），发现 14 株分属于 Aspergillus(6 株)、 Penicillium(2 株 ) 、 Mucor(3 株 ) 、 Rhizopus(1 株 ) 、 Gibberella(1 株 ) 、 Cladosporium(1 株)6 个属。这表明尽管窖房空气中糖化酶产生菌总数相对较 少，宜宾多粮浓香型白酒酿造环节窖房空气中产糖化酶的霉菌种属分布和系统 发育却呈现出丰富的多样性。 在系统发育树（图 1）上聚在 1 条直线上，属于 Aspergillus 的 J8M-53、 G8M-18、Z8M-16 的 3 株菌，其序列虽然 100%相似，
编辑 李严
